CHIP
CHIP及ChIP-seq實驗服務
染色質免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）是用于研究體內DNA與蛋白質相互作用的方法。CHIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。通過對ChIP富集得到的DNA片段進行大規模測序（ChiP-seq），可獲得數百萬條序列標簽，并能把所關注的蛋白的DNA結合位點精確定位到基因組上。ChiP-seq具有背景低、信噪比高、定位精度高、高靈敏度等優勢。
一、CHIP實驗流程
1. 交聯固定：配置1% PBS甲醛，然后將10ml的1%甲醛加入到樣本中；室溫搖床慢搖10min,用500 ul 2.5M 甘氨酸中止固定，繼續慢搖5 min;然后300g,5min離心。
2. 取細胞核：棄培養液，用大量冰預冷的PBS洗3遍，每一遍洗完后300g,5min離心，最后棄上清保留固定過的樣本，用1ml IP dilution buffer重懸；
3. 染色質片段化：樣品轉到2ml EP管，冰上超聲：20次，30s on/30s off;13200rpm,10min ,4度，收集上清，留取50ul用作In put備用；
4. 孵育：將上清分成兩份，一份加入IgG抗體，一份加入目的蛋白抗體，然后4度孵育過夜；在孵育好的抗體-超聲裂解物中加入 Protein G beads,然后4度孵育4小時；
5. 洗脫：使用Wash buffer wash Beads 4次后，使用Elution buffer進行洗脫；在洗脫產物中加入蛋白酶K,65度消化過夜；
6. 純化：用QIAquick PCR Purification Kit 純化樣品；
7. CHIP-qPCR檢測：設計引物，通過qPCR進行目標基因的定量檢測。
CHIP-qPCR示例圖
二、CHIP-seq實驗和數據分析
（一）CHIP-seq實驗過程
CHIP實驗獲得的DNA樣品進行建庫，上機測序。
本研究使用 Diagenode 公司 MicroPlex Library Preparation Kit v2 為例，進行ChIP-seq 建庫，具體操作步驟如下：
1. 樣本質檢：在建庫之前需要對樣本進行質量控制檢測。使用 Life 公司 Qbit 定量 試劑盒對 ChIP 得到的 DNA 樣本進行定量。然后使用安捷倫公司 2100DNA 電泳儀 對微量的 DNA 進行片段大小確認。（要求 DNA 含量>0.5 ng/μL,片段分布在 100-600 bp 之間）
2. 末端修復、磷酸化并加dA尾：取5μL ChIP得到的dsDNA,加入2μL Template
Preparation buffer 及 1μL Template Preparation Enzyme.混勻后放入 PCR 儀中。22°C25 分鐘，55°C20 分鐘，4°C2 分鐘。
3. 接頭連接：在樣本中加入1μL Library Synthesis Buffer及1μL Library Synthesis Enzyme.混勻后放入 PCR 儀中。22°C40 分鐘，4°C2 分鐘。
4. PCR 擴增：在樣本中加入 25μL Library Amplification Buffer、1μL Library Amplification Enzyme 及 4μL Nuclease-free Water.混勻后放入 PCR 儀器中。
5. PCR 擴增產物純化
a. 前取出 AMPure XP beads 放置于室溫，渦旋震蕩混勻。
b. 在樣本中加入 50μL （1X） AMPure XP beads,使用移液器混勻。
c. 室溫孵育 5 分鐘。
d. 將混合樣本短暫離心（不超過 500 rpm）并置于磁力架中。待溶液澄清后（約 8 分 鐘），小心移除上清。
e. 保持離心管始終處于磁力架中，加入 300μL 新鮮配制的 80%乙醇。室溫孵育 30 秒，小心移除上清。重復此步驟兩次。
f. 將離心管放于 37°C 金屬浴中，開蓋干燥磁珠 2 分鐘。
g.加入 25μL Nuclease-free Water 進行 DNA 洗脫。渦旋振蕩使充分混勻。將反應管短暫離心并置于磁力架中。待溶液澄清后（大約 8 分鐘），小心吸取 22μL 上清至滅菌 PCR 管中。即得 DNA 文庫。
h.上機測序。
（二）CHIP-seq數據分析
a. 測序數據質量評估；
b. 與參考基因組比對分析；
c. peak峰calling分析；
d. motif識別與分析；
d. peak峰相關基因注釋；
e. 差異peak分析；
f. 相關基因GO,KEGG富集分析等。
結果展示：
圖1. Quality scores Per base sequence quality
圖2. CHIP-seq 數據可視化示例
圖3. peaks在基因組功能性區域的分布統計圖
圖4. 基因附近的平均信號分布
圖5. motif分析結果示意圖
圖6. CHIP-seq信號富集heatmap
圖8. 基因的GO富集示意圖
圖9. KEGG富集分析示意圖
