RNA pull down
RNA pull down 實驗
RNA pull-down 是檢測 RNA 結合蛋白與其靶 RNA 之間相互作用的主要實驗手段之一。RNA pull-
down 使用體外合成或者體外轉錄法標記生物素 RNA 探針，然后與細胞裂解后的蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質復合物。該復合物可與鏈親和素標記的磁珠結合，從而與孵育液中的其他成分分離。復合物洗脫后，通過 Western Blot 實驗檢測特定的 RNA 結合蛋白是否與 RNA 相互作用。因此，RNA pull down 常被用來研究 LncRNA 相互作用的蛋白。
實驗步驟
1.準備細胞裂解物
a.收取目的細胞（~107），1000 rpm，4℃離心 5min 收獲細胞，棄去上清。
b.使用加入 1ml 冰冷的 PBS 重懸細胞，1000 rpm，4℃離心 5min。
c.加入 500 ul Cell lysis buffer （+新鮮的蛋白酶抑制劑，RNAse 抑制劑，DTT）重懸沉淀，置于冰上 5min，期間顛倒混勻幾次。
d.13000g，4℃離心 10min。
e.收集上清直接用于實驗或儲存于-80 ℃。
2.制備生物素標記的 RNA
（1）制備 DNA 模板
（2）體外轉錄實驗
（3）標記 RNA 探針
3.RNA 進行 Pull down 實驗
a.取 150 µl Pierce Nucleic-Acid Compatible Streptavidin Magnetic Beads，使用 Wash Buffer 洗滌 beads 兩 次，去除 stock solution，最后使用 RNA Capture Buffer 重懸 Beads。
b.在 Beads 中加入已經標記好的 Biotin-RNA，孵育 15-30 分鐘。
c.使用 Wash Buffer 洗滌 beads 兩次，使用 1xProtein-RNA Binding Buffer 重懸 Beads。
d.進行 Pull-down 實驗。體系如下：
| 10X Protein-RNA Binding Buffer | 10 µL |
| 50% glycerol | 30 µL |
| Additional salts, etc. | 10 µL |
| Lysate (protein conc. > 2mg/mL) | 30 µg |
| Nuclease-free water to 100µL | |
e.在 rotary shaker 中 4 ℃翻轉孵育 1 h。
g.使用 50 µL Biotin Elution buffer 洗脫蛋白，進行下游分析。
4.蛋白鑒定：對Pull down產物進行WB實驗或者做蛋白質譜鑒定
實驗結果
銀染圖
質譜鑒定
WB檢測
此外，RNA pull down技術也應用在RNA-RNA之間的互作研究中，例如miRNA與lncRNA的結合，這時pull down的產物的RNA，對產物的鑒定需要做PCR，結果如下圖：
