luciferase
雙熒光素酶報告基因實驗（luciferase assay）是研究基因之間調控機制的方法之一，其闡述的是DNA-DNA,RNA-DNA的調控關系。常見的研究有轉錄因子TF與靶基因的調控、miRNA與靶基因的調控，miRNA與lncRNA/circRNA的調控。
這里以miRNA與靶基因的調控研究為例，描述luciferase的研究過程。
一、生物信息學分析
通過生物信息學分析預測miRNA與靶基因3'UTR區域的結合位點。根據結合位點序列設計突變位點序列。
二、載體構建
分別構建以下過表達質粒：
1. miRNA過表達質粒、miRNA-NC
2. 靶基因3'UTR野生型質粒WT（LUC載體）
3. 靶基因3'UTR突變型質粒MUT（LUC載體）
三、Luciferase檢測
1. 細胞培養：
以RPMI1640培養基擴增培養293T細胞，至指數生長期，1200rpm離心4min.
2. 細胞鋪板：
以血球計數板計數收集的293T細胞，調整細胞密度為105/ML,然后接種至24孔板，每孔的細胞數量4×104.
3. 細胞轉染：
根據lipo3000的操作說明進行共轉，共轉染分組如下：
A:miRNA + 靶基因3'UTR-WT
B:miRNA + 靶基因3'UTR-MUT
C:miRNA-NC + 靶基因3'UTR-WT
D:miRNA-NC + 靶基因3'UTR-MUT
每組同時轉染海腎熒光素酶質粒pRL-TK作為內參。
4. 雙熒光素酶活性檢測：
4.1 細胞裂解：
細胞轉染48h后，棄上清，并以PBS輕輕洗滌一次細胞，然后每孔加入200ul細胞裂解液，冰育5-10min,充分裂解細胞；
4.2 工作液配制：
按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書，分別以對應的緩沖液稀釋螢火蟲熒光素酶底物、海腎熒光素酶底物至1×，冰上靜置；
4.3 熒光檢測：
取4.1中裂解液20ul,加入96孔酶標板中，加入100ul螢火蟲熒光素酶反應液，放入酶標儀，設置震板混勻，檢測螢火蟲熒光素酶活性；
檢測完螢火蟲熒光素酶活性后，每孔加入100ul海腎熒光素酶反應液，放入酶標儀，設置震板混勻，檢測海腎熒光素酶活性。
5. 數據分析、作圖。
