coIP
免疫共沉淀coIP實驗
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。
coIP實驗過程：
1.用5ml槍頭刮取細(xì)胞表面，然后抽吸懸液轉(zhuǎn)移到15ml細(xì)心管中，4℃，1200rpm,離心3min中。
2.加入1ml冰冷的PBS重懸細(xì)胞，1200rpm,4℃離心3min.
3.棄去上清，加入1ml體積的IP dillution buffer,然后votex3次，每次votex震蕩混勻后靜止置2min,裂解過程中同時加入PMSF（250mmol,1:250加入）和PIC（100mmol,1:100加入），總共裂解10min,便于細(xì)胞充分裂解完全。
4.轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，12000rpm,4℃離心10min中。
5.將上述上清留取50ul用于input對照，剩下的上清分別分裝2管（標(biāo)記HSP27抗體樣品管，IgG抗體樣品管）保存負(fù)80度或用于抗體孵育實驗。
6.取100ul的瓊脂糖珠，加入1ml體積的IP buffer,4000r/30s,清洗一次，后棄去上清。
7.將上清轉(zhuǎn)移至含有瓊脂糖珠的EP管中，4℃磁力架上搖擺過夜。
8.離心，加1ml的IP buffer后4000r/30s,移液槍吸，棄上清，洗滌4次，洗干凈，每次吹打10次，輕柔混勻。
9.洗滌完成后，加入40ul的loading buffer.
10.100℃煮樣5-10min,然后保存負(fù)20或者用于Western blot檢測。
11.Western Blot檢測目標(biāo)蛋白。
coIP樣品WB檢測示意圖
