細胞凋亡
一、實驗原理
細胞凋亡或稱程序性細胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細胞的生命現象之一，它在機體的胚胎發育、組織修復及自身反應性T淋巴細胞的清除等方面起著十分重要的作用。細胞凋亡調節的失控可導致臨床各種疾病的發生。如老年性癡呆與神經細胞凋亡過度有關，自身免疫性疾病和腫瘤與細胞凋亡的抑制有關。細胞凋亡有別于細胞壞死，它有一系列的細胞形態學和生物化學的改變，包括出現染色質濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine， PS）位于細胞膜的內側，但在凋亡的細胞，PS從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-Ⅴ（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合。因此將Annexin-Ⅴ進行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標記，以標記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。
二、實驗步驟
1. 取1塊24孔板，接種指數生長期目的細胞：100000個/孔，設置NC對照組及實驗組，3復孔/組；
2. 細胞接種24h后，更換新鮮RPMI1640培養基500ul（含2%FBS）；
3. 取lipofilter約2.4ul，以RPMI1640培養基（含2%FBS）47.6ul混勻，室溫靜置5min；
4. 取制備的siRNA約50pmol（2ul），以RPMI1640培養基（含2%FBS）46ul混勻；
5. 將步驟3與4準備的2管溶液混合，輕輕混勻，室溫靜置20min后加入步驟b的細胞中；
6. 培養6h后，更換新鮮RPMI1640培養基（含10%FBS）500ul，繼續培養；
7. 培養72h后，300g，4℃，離心5min；
8. 以預冷PBS重懸細胞，并300g，4℃，離心5min；
9. 棄PBS，加入100ul的1*Binding buffer重懸細胞；
10. 加入5ul的Annexin V-FITC和10ulPI Staining Solution，輕輕混勻；
11. 避光，室溫反應10-15min；
12. 加入400ul 1*Binding Buffer，混勻后放置于冰上，在1h以內流式檢測。
三、注意事項
1. 整個操作過程動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細胞，盡量在4 ℃下操作。
2. 反應完畢后要盡快檢測，因為細胞凋亡是一個動態的過程，反應一小時后熒光強度就開始衰變。
3. Annexin V-FITC是光敏物質，在操作時要注意避光。
FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡示例圖
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